Projet

PROJET SCIENTIFIQUE : Interactions ARN/protéines : aspects évolutifs.
Le projet vise à étudier les interactions ARN/protéines de la famille RBMX/RBMY chez des espèces présentant deux systèmes génétiques du déterminisme du sexe : la souris (mammifère) : XX/XY ; Pleurodeles waltl , Xenopus tropicalis: ZZ/ZW (amphibiens). Les différents gènes de cette famille ont été identifiés chez l’homme : RBMX, localisé sur le chromosome sexuel X, dont le rôle reste à préciser ; RBMY, localisé sur le chromosome Y et qui aurait évolué par rapport à son homologue RBMX et acquis une fonction dans la fertilité mâle ; hnRNPG-T, localisé sur le chromosome 11 dériverait de RBMX par rétrotransposition et aurait un rôle dans la spermatogenèse ainsi que d’autres pseudogènes dispersés sur des autosomes. Chez l’amphibien, nous avons identifié dans l’ovocyte de P. waltl l’homologue de la protéine humaine hnRNPG (codée par le gène RBMX) et nous l’avons appelé RBMW (pour RNA binding motif linked to the chromosome W). De plus,nous avons mis en évidence son interaction spécifique ainsi que celui d’hnRNPG avec un ARN hétérogène simple brin de 159 bases, marqueur du chromosome sexuel W de P. waltl (W_Ec).

PROGRAMME DE LA RECHERCHE

Afin de déterminer si l’activité de liaison de RBMW et d’hnRNPG à l’ARN W_Ec est la même quel que soit le type cellulaire considéré, une analyse en « Northwesternblot » sera effectuée en utilisant des extraits protéiques issus de tissus gonadiques ou somatiques et séparés par électrophorèse mono et bidimensionnelle. Les déterminants de cette spécificité seront ensuite caractérisés en analysant les modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse de type LC-MS-MS. Le ou les domaines protéiques d’hnRNPG qui interagissent avec l’ARNW_Ec seront définis. Pour cela, l’étude de liaison à l’ ARNW_Ec. de la protéine entière ou tronquée de plusieurs de ses domaines sera effectuée par « Northwestern blot ». Le motif nucléique contenu dans les 159 bases de l’ARNW_Ecsera identifié par la technique de pontage nucléaire intrinsèque et par Résonance Plasmonique de Surface (SPR) (Biacore).

Enfin, Le modèle amphibien, grâce aux caractéristiques de ses chromosomes en écouvillon, présente également un intérêt particulier pour l’étude des interactions ARN/protéines in vivo. Par vidéo microscopie et par microscopie confocale, nous examinerons chez P. waltl et X. tropicalis à quelle boucle de transcription se lie la protéine recombinante RBMW couplée à la GFP/Flag.

Ce programme comprend plusieurs parties qui peuvent être menées d’une manière indépendante. Plusieurs d’entre elles peuvent faire l’objet d’un Stage M2 du Master « Biologie Moléculaire et Cellulaire » et pourront être prolongées par une thèse.

Rapport du Dr May Penrad-Mobayed , responsable de l'encadrement du stage au laboratoire de Rasha Kanhoush

Stage entrepris par Rasha Kanhoush à l'Institut Jacques Monod (UMR 7592, CNRS/Universités Paris 6 et Paris 7), Groupe « Interactions ARN/protéines et différenciation du sexe », responsable : Dr May Penard-Mobayed

(novembre 2004- juin 2005)

Sujet du stage

«Etude de l' hnRNPG, une protéine de liaison à l'ARN »

Introduction
Les complexes ribonucléoprotéiques jouent un rôle primordial dans la régulation de l'expression des gènes. Le projet consiste à effectuer une étude comparative des interactions ARN/protéines en prenant comme modèle la protéine hnRNPG qui appartient à la famille RBMX/ RBMY dont les différents membres ont acquis des fonctions différentes au cours de l'évolution.

hnRNPG est une glycoprotéine appartenant à la famille des hnRNPs, (ribonucléoprotéines

hétérogènes) qui jouent de multiples rôles dans la régulation post-transcriptionelle. Le gène codant pour cette protéine a été localisé sur le chromosome X (RBMX) chez l'homme et la souris Il présente de fortes homologies avec ceux de la famille multigénique RBMY (RNA-Binding Motif, linked to the Y chromosome) localisés sur le chromosome Y, qui jouent un rôle dans la fertilité mâle. RBMX et RBMY constituent un modèle pour l'étude de l'évolution des chromosomes X et Y chez les mammifères. Ils seraient membres d'une ancienne paire de gènes localisée sur les proto-chromosomes sexuels. Ces gènes se seraient différenciés et évolués séparément. RBMY a acquis une fonction spécifique à la reproduction et à la fertilité mâle alors que le rôle d'hnRNPG codée par RBMX reste à préciser.

Nous avons pu montrer au laboratoire, par analyse de type « Northwestern blot » couplé à l'électrophorèse bidimentionnelle qu'il existe plusieurs isoformes correspondant à l'hnRNPG humaine, dont une seule présente une activité de liaison à l'ARN. D'autre part, nous avons pu identifier l'existence de plusieurs isoformes homologues de l'hnRNPG humaine, dans des extraits gonadiques de l'amphibien Pleurodeles waltl (déterminisme génétique du sexe de type ZZ (homozygotie mâle) et ZW (hétérozygotie femelle)). Seule l'isoforme présente dans le génotype ZW, a une activité de liaison à l'ARN et semble donc liée au chromosome sexuel W.

Objectif du stage

Les analyses par hybridation in situ et par immunolocalisation effectuées par d'autres équipes de recherches, montrent qu'hnRNPG est exprimée d'une manière ubiquitaire. Cependant, ce type d'approche ne permet pas de distinguer les différentes isoformes correspondant à cette protéine et ne permet donc pas d'attribuer à une isoforme particulière, un rôle précis.

Par contre, l'approche protéomique que nous avons utilisée a permis de montrer une activité différentielle de liaison à l'ARN de certaines isoformes correspondant à cette même protéine, ce qui doit reflèter des rôles différents.

l'hnRNPG humaine présente deux domaines. Un domaine de liaison à l'ARN « RNA Binding Domain (RBD) de 80 acides aminés qui contient les deux motifs de liaison à l'ARN : RNP1 et RNP2, et un domaine auxillaire basique en C-terminale. Ce dernier peut être également scindé en deux parties . l'une est basique , riche en acides aminés pouvant être phosphorylés.( sérine arginine et glycine) ; des motifs de liaison à l'ARN (RGG) pouvant être méthylés et deux motifs (SSRD) et (PSME) pouvant être glycosylés. Cette partie peut intervenir dans des interactions ARN/protéine. L'autre partie est riche en leucine, pouvant intervenir dans des interactions protéine-protéine .

L';une des premières questions que l'on peut donc se poser concerne la différence de liaison à l'ARN observée au niveau des différentes isoformes d'hnRNPG. Est-elle due à des différence dans leur degré de phosphorylation et/ou glycosylation (modifications post-traductionnelles )?

Pour y répondre, Rasha Kanhoush a entrepris une approche protéomique pouvant mettre directement en évidence le degré de phosphorylation et/ou de glycosylation de ces différentes isoformes. Cette approche consiste à analyser des extraits nucléaires des cellules HeLa ou des extraits gonadiques d'amphibiens, par électrophorèse bidimensionnelle suivie par des colorations spécifiques des protéines phosphorylées et glycosylées, nouvellement introduites sur le marché .

Dans la deuxième partie de son stage, Rasha Kanhoush va essayer de définir les domaines de liaison à l'ARN d'hnRNPG. Pour cela, elle va essayer d'exprimer in vitro cette protéine à partir des cDNAs correspondant à l'hnRNPG humaine, entier ou tronqués dont nous disposons. Cette liaison sera suivie par analyse de type « northwestern blot »