Approche protéomique du rôle
de la protéine HnRNPG/RBMX dans la régulation génique
Les
complexes ribonucléoprotéiques jouent un rôle primordial dans la régulation de l’expression des gènes. Le projet consiste
à effectuer une étude comparative des interactions ARN/protéines en prenant comme
modèle la protéine hnRNPG qui appartient à la famille RBMX/ RBMY dont les différents membres ont acquis des fonctions différentes
au cours de l’évolution.
HnRNPG/RBMX(RNA-Binding
Motif, linked to the X chromosome) est une glycoprotéine appartenant à la grande famille des hnRNPs, (ribonucléoprotéineshétérogènes) qui jouent de multiples rôles dans la
régulation post-transcriptionelle. Le gène (RBMX) codant pour cette protéine a
été localisé sur le chromosome X chez l’homme et la souris. HnRNPG/RBMX fait partie de la famille RBMX/RBMY qui comprend le gène RBMY (RNA-Binding Motif, linked
to the Y chromosome) localisé sur le chromosome Y ; le gène HNRPG-T , localisé
sur le chromosome 11p15 et plusieurs gènes RBMXLs (RBMX like-sequences) qui sont localisés sur les chromosomes 1, 6p12
et 9p13 . Cette famille constitue un modèle pour l ‘étude de l’évolution
des gènes liés aux chromosomes sexuels. Ces gènes se seraient différenciés et évolués séparément. RBMY et HNRPG-T ont acquis une fonction spécifique à la reproduction et à la fertilité mâle alors que le rôle
de RBMX et de RBMXLs reste à préciser.
Etant donné que les protéines conceptuelles de RBMXLs présentent 92-96% d’identité
avec HnRNPG/RBMX, les analyses classiques par hybridation in situ et par immunolocalisation ne permettent pas de distinguer ces différentes protéines entre elles et ne permettent
donc pas d’attribuer à une protéine particulière, un rôle précis. C’est
pourquoi, nous avons développé une approche protéomique (Electrophorèse bidimensionnelle couplée à la technique de « northernblot »,
à l’immunodétection et à la spectrométrie de masse ) qui nous a permis de mettre en évidence, dans les extraits
nucléaires des cellules HeLa, plusieurs spots protéiques correspondant à HnRNPG/RBMX
et/ou à RBMXLS. Ces spots présentent une activité différentielle de liaison à l’ARN, liée à des modifications post-traductionnelles
de la protéine (phosphorylation, glycosylation..). Cette activité différentielle de liaison à l’ARN reflète donc une
fonction différente que peuvent jouer ces différentes protéines dans la régulation de l’expression des gènes. Ces protéines
sont en cours d’identification par spectrométrie de masse de type LC-MS-MS.
Objectif du stage
Le
ou les domaines protéiques de hnRNPG/RBMX qui interagissent avec ARNWEc seront définis. Pour cela, l’étude
de la liaison à l’ ARNWEc. de la protéine entière ou
tronquée de plusieurs de ses domaines sera effectuée par « Northwestern blot ». Ces protéines seront exprimées à
partir de cDNA correspondant à la protéine humaine, entière ou tronquée de plusieurs de ses domaines
Afin
de déterminer si l’activité de liaison de hnRNPG/RBMX à l’ARN est la même quel que soit le type cellulaire considéré,
une analyse en « Northwesternblot » sera effectuée en utilisant des protéines nucléaires extraites à partir de tissus
gonadiques ou somatiques de souri. En fonction des résultats obtenus, les déterminants de cette spécificité seront caractérisés
en analysant les modifications post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation, méthylation) par des colorations spécifiques
et par spectrométrie de masse de type LC-MS-MS.
